巯基检测



1. 样品及指标信息

样品:液体样本1

指标:巯基

2. 实验方法简介

生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质,而且参与活性氧清除,后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和 GSH 含量,能够间接测定蛋白质巯基含量。

巯基基团与 5,5’-二硫代--硝基苯甲酸(DTNB)反应,生成黄色化合物,在 412nm 处有最大吸收峰。

Sulfhydryl Group + 5, 5,- Dithiobis-2-Nitrobenoic acid 2-Nitro-5-Mercaptobenzoic Aicd (412nm)

 

3. 要试剂

试剂名称

规格

保存条件

提取液

0.01MPBS 60 mL×1

2-8℃保存

试剂一

0.1M PBS 20 mL×1

2-8℃保存

试剂二

DTNS溶液 1 mL×1

2-8℃保存

标准品

半胱氨酸×1

2-8℃保存

4. 仪器和设备

1. 可见分光光度计/酶标仪。

2. 水浴锅。

3. 可调式移液器。

4. 微量比色皿/96 孔板。

5. 试样制备

液体样本:直接测定。不浓度过高,可以用蒸馏水稀释上样,若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。

6. 分析步骤

1.  分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,分光光度计蒸馏水调零。


2. 标准液的稀释:将25μmol/mL标准溶液用蒸馏水稀释至0.50.250.1250.06250.031250.015625μmol/mL的标准液,现用现配。

3.  操作表

试剂名称

对照管

测定管

标准管

空白管

样本(μL

40

40

-

-

标准品(μL

-

-

40

-

试剂一(μL

150

150

150

150

试剂二(μL

-

10

10

-

H2OμL

10

-

-

50

混匀,室温准确静置10min,测定412nm吸光值,分别记为A对照、A测定、A标准、A空白,并计算ΔA      标准= A标准-A空白、ΔA测定= A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2

次。

7. 结果计算

1、标准曲线的绘制:根据标准管的浓度(y,?mol/mL)和吸光度ΔA标准(x,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA测定(x,ΔA测定)带入公式计算样本浓度(y,μmol/mL)。

2、总巯基含量计算:

(1) 按样本质量计算:总巯基含量(μmol/g 质量)=y×V样总÷W=x÷W

(2) 按样本蛋白浓度计算:总巯基含量(μmol/mg prot)=y×V样总÷(Cpr×V样总)=y÷Cpr

(3) 按血清、培养液体积计算:总巯基含量(μmol/L)=y×V样÷(V样×10-3=1000y

V样总:加入提取液体积,1mL;V样:加入的样本体积,0.04mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度, mg/mL;10-3:单位换算系数,1mL=10-3L。

注意事项:

如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。注意同步修改计算公式。

8. 实验结果与分析

见附件(Excel表格)


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